Educação Fatores a considerar ao projetar Primer

Escolher uma secção de pares de bases, no início e no fim do gene para a iniciadores directos e inversos. Cada iniciador é complementar à respectiva secção. Lembra-te, o ADN é sintetizado a partir da 5 'a 3', de modo a que o iniciador de 5 'para a frente deve ser complementar à cadeia do fundo, e o iniciador 3' reverso deve ser livre para o fio superior.

Concepção de iniciadores a ser 18-21 nucleótidos de comprimento. Isto ajuda a impedir a ligação não específica do iniciador, proporcionando a sequência é complementar de uma secção, mas ainda contém um comprimento suficiente para hibridarem correctamente.



O desenho de primers para ter uma temperatura de fusão de 50-60 graus Celsius. Uma fórmula simplificada para a estimativa da temperatura de fusão de um iniciador é t = 2 (A + T) + 4 (G+ C).

O desenho de primers para que contêm 40-60 por cento de G e C nucleótidos. Isto ajuda a assegurar que a temperatura de fusão é suficientemente elevada. Certifique-se que as temperaturas de fusão de cada par de primers estão 5 graus de separação.

Evitar a complementaridade das duas ou três bases na extremidade 3 'dos ​​iniciadores. Isto reduz a formação de dímero de primer, que ocorre quando o emparelhamento do iniciador entre elas, em vez de para o gene de interesse.

Projetando um grampo GC na sua cartilha. Coloque as bases G e C ao longo dos últimos cinco bases da extremidade 3 'de cada iniciador. Isto ajuda a promover a ligação específica da extremidade 3 '. Isto é devido à forte ligação de bases G e C evitar mais de três G e C nos últimos cinco bases da extremidade 3 'de cada iniciador.

Evitar colocar um T no iniciador 3 '. Estes iniciadores têm um desfasamento maior tolerância.

Evite repetições consecutivas de dois pares de bases (repete di-nucleotídeo) e isso pode causar mispriming. Quatro ou menos repetições de nucleotídeos são ideais.

Evite trechos de uma única base, pois isso também pode causar mispriming. Evite mais de quatro bases repetidas em uma fileira.