Educação

Arrefece-se a temperatura da célula da amostra de 41 a 50 graus Fahrenheit. Isto permite uma melhor taxa de absorção do material fluorescente a partir das células.

Coloque a célula de amostra com uma substância fluorescente induzindo como BCECF. Isto é feito por adição do BCECF de meia célula, depois de se agitar suavemente a mistura durante 2,5 horas. O BCECF é absorvido através da membrana permeável das células.



Separam-se as células a partir do meio e de qualquer BCECF não absorvida pela execução da amostra através de uma centrífuga. Colocar as células em um recipiente separado.

Aquece-se a célula de amostra de 98,6 graus centígrados, durante 30 minutos, para aproximar as condições no interior do corpo humano. Se as células em questão, normalmente vivem noutro ambiente que o corpo humano, para ajustar a amostra até à temperatura adequada.

Excite a célula de amostra, mexendo. Isto ajuda a aumentar a actividade fluorescente.

Medindo a intensidade de fluorescência da amostra de células utilizando um espectrofotómetro. Para melhores resultados, usar a luz em comprimentos de onda de excitação de 500-510 nanômetros. A estes comprimentos de onda, há uma maior difusão de intensidade de fluorescência, de modo a facilitar a diferenciação entre os resultados. A intensidade de fluorescência é medida em unidades de fluorescência relativas (RFU), a relação entre o brilho da substância num estado animado, a fluorescência ao seu estado não-animado normal. Quanto maior é a RFU, substância luminosa, em comparação com o seu estado normal.

Compare os resultados das curvas de calibração espectrofotômetro pré-concebidas. Em geral, a fluorescência mais elevada significa que um pH mais elevado dentro da amostra. Com o comprimento de onda de excitação de 510 nm, uma substância com um pH de 6,4 apresentam uma RFU de cerca de 20, enquanto que uma substância com um pH de 9,9 apresentam uma RFU de cerca de 55.