Educação

Estudo e familiarizar-se com PCR e protocolos de clonagem. Há uma grande quantidade de informação de base que é necessária para compreender a biologia molecular, a fim de maximizar o sucesso da clonagem e da eficiência. Protocolos e kit de clonagem Muitos estão disponíveis comercialmente a partir de empresas como a Qiagen, Invitrogen, Promega, e outros, a fim de determinar o que é necessário para clonar e escolher os materiais e recursos.

Realizar uma reacção de PCR do gene de interesse. O processo de PCR envolve ciclos de aquecimento e arrefecimento para o seu desnaturar o DNA de cadeia dupla, bind (recozimento) pequenos fragmentos de DNA chamados primers para flanquear o gene e construir novas fitas complementares de DNA com uma enzima DNA polimerase. Estes passos são repetidos 40 a 50 vezes, duplicando o seu DNA de cada ciclo, fazendo com que milhões de cópias de seu gene. Você precisa saber a seqüência do gene, a fim de projetar primers apropriados para ligar com sucesso para a região do gene desejado. Dependendo do método de clonagem - blunt-end ou TA clonagem, por exemplo - você pode precisar usar uma enzima como a Taq DNA polimerase, que não têm a capacidade de revisão, de modo que como você construir seus novos filamentos de DNA Para adicionar a saliência do terminal para o primeiro 3 finale, a criação de um "mau fim".



Purifica-se o produto de PCR, se desejado. Este passo pode ser feito de várias maneiras, tais como através de filtros de colunas de giro para lavar qualquer iniciador remanescente ou enzimática ou por executar o produto de ADN por electroforese em gel e cortar e lavar a banda de DNA.

Amarre o produto purificado gene PCR em um vetor plasmídeo apropriado. Se você estiver usando um kit adquirido comercialmente, um vetor plasmídeo, como pGEM ou pCR2.1 serão fornecidos. Defina o seu kit de reacção de ligação de acordo com as recomendações do fabricante ou a adição de quantidades recomendadas de produto de PCR, de tampão de ligação, plasmídeos e enzima DNA ligase. A reacção de ligação irá permitir que o plasmídeo circular para tirar o gene no seu genoma.

Realizar uma reacção de transformação, em que o vector de plasmídeo com a inserção do gene é feita no genoma das células bacterianas, geralmente E. coli. Faça placas de ágar vários dias de antecedência, em preparação para essa transição e mantê-los na incubadora. Combine o seu plasmídeo com células de perto aderindo aos volumes de reagente e tempos de incubação referidos no protocolo em uso. Explicar as células bacterianas em placas de agar e incubados a 37 graus Celsius, durante a noite.

Triagem placas de ágar para colônias de bactérias azuis e brancos. As colônias contendo a inserção de genes será branca, não azul. Escolha várias colônias brancas e cultivá-las em meio de LB com ampicilina para obter uma grande quantidade de bactérias com o gene inserção clonada. Agora você tem uma grande quantidade de gene backup. Para fazer a busca do gene clonado, utilizando um kit disponível comercialmente para o isolamento de DNA de plasmídeo a partir de células bacterianas e purifica-se o gene. Guarde na geladeira até que esteja pronto.